本发明涉及生物检测领域,提供了一种抗CK19蛋白单克隆抗体,其重链和轻链可变区的氨基酸序列分别是SEQ ID NO.2和SEQ ID NO.3所示的氨基酸序列。发明人还提供了抗CK19蛋白单克隆抗体的制备方法,选取人CK19氨基酸SEQ ID NO.1序列并与KLH偶联,在其羧基端添加了一个半胱氨酸后,作为免疫原。发明人还提供了一株分泌抗CK19蛋白的杂交瘤细胞系,所述细胞系为小鼠杂交瘤细胞系AbM58058‑41A2‑PU,保藏号为:CGMCC NO.17489。抗CK19蛋白单克隆抗体,具有高特异性、敏感性,可以特异性识别表达CK19蛋白的细胞,适用于免疫学检测,特别是免疫组化检测。